1.多管發(fā)酵法
初發(fā)酵實驗
復發(fā)酵實驗
2.濾膜法
濾膜是一種微孔性濾膜,孔徑0.45μm。將水樣注入已滅菌的放有濾膜的過濾器中,經(jīng)過抽濾,細菌即被截留在膜上,然后將濾膜貼于M-FC培養(yǎng)基上,在44.5℃±0.5℃下培養(yǎng)24 h±2h。糞大腸菌群菌落在M-FC培養(yǎng)基上呈藍色或藍綠色,其他非糞大腸菌群菌落成灰色、淡黃色或無色。正常情況下,由于溫度和玫瑰酸鹽試劑的選擇性作用,在M-FC培養(yǎng)基上很少見到非糞大腸菌菌落。
二.兩種方法的注意事項
1.培養(yǎng)溫度的要求
2.加氯水樣的處理
3.樣品的保存
4.培養(yǎng)物質(zhì)的制備與保存
⑵.濾膜法所采用的M-FC培養(yǎng)基多使用外購的成品,培養(yǎng)基中苯胺藍的純度和質(zhì)量往往影響菌落的顏色,因此,無菌包裝的成套培養(yǎng)基在使用前,先接種典型糞大腸菌,以觀察對比菌落的顏色,來鑒定其穩(wěn)定性。
5.結(jié)果統(tǒng)計
⑴.多管發(fā)酵法的結(jié)果是根據(jù)不同接種量的發(fā)酵管所出現(xiàn)陽性結(jié)果的數(shù)目,從MPN表中查得相應的MPN指數(shù),來計算每升水中糞大腸菌群細菌的MPN值。MPN是“Most Probable Number”的縮寫,指zui大可能數(shù),它是根據(jù)統(tǒng)計學理論,估計水體中的菌群密度和衛(wèi)生質(zhì)量的一種方法,所以準確判斷不同接種量發(fā)酵管的陽性數(shù)是非常重要的,否則將導致較大偏差。
⑵.濾膜法的結(jié)果是計數(shù)濾膜上呈藍或藍綠色的菌落,來計算出每升水樣中的糞大腸菌群數(shù)。所以為便于計數(shù),減少誤差,理想的水樣體積是一片濾膜上生長20-60個糞大腸菌群菌落。
三.在實際中的應用探討
1.檢測方法對樣品的適用性
⑴.多管發(fā)酵法由于只需要根據(jù)水樣的取樣量來決定將樣品培養(yǎng)于何種培養(yǎng)液中(單倍或是三倍乳糖)進行培養(yǎng),因此理論上可適用于各種水樣,但由于受發(fā)酵管容積的限制,其更適合檢測水源水、地表水和污染源廢水(取樣量不大),而且如果接種的水樣量不是MPN表中的三種接種量時,還需用公式進行換算。
⑵.濾膜法主要是采用抽濾裝置將細菌截留在濾膜上,然后將濾膜貼附在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng),因此可用于檢測體積較大的水樣,但受濾膜孔徑的限制,在檢測混濁度高(污染源廢水)、非大腸桿菌類細菌密度大(河湖水)的水樣時,對菌落計數(shù)統(tǒng)計有一定影響,此外,如水樣中有毒性物質(zhì)較高,也會在濾膜上形成累積,抑制細菌培養(yǎng)。
2.檢測時間及操作過程的繁瑣度
⑴.多管發(fā)酵法需要經(jīng)過初發(fā)酵試驗和復發(fā)酵試驗兩個過程后才能根據(jù)不同接種量的發(fā)酵管所出現(xiàn)陽性結(jié)果的數(shù)目,從MPN表中查得相應的MPN指數(shù),從而zui后得出每升水中糞大腸菌群細菌的MPN值??梢钥闯?,多管發(fā)酵法的培養(yǎng)時間至少需要2天以上,且對接種量、每一接種量的發(fā)酵管數(shù)都有嚴格要求(MPN表多采用9管、15管發(fā)酵管,接種量為10ml、1ml、0.1ml3種體積查詢),否則結(jié)果難以統(tǒng)計。
⑵.濾膜法目前主要采用成套NPS(濾膜+培養(yǎng)基+培養(yǎng)皿)進行細菌截留和培養(yǎng),操作簡單,使用時只需用少量無菌水潤濕培養(yǎng)基墊即可使用,培養(yǎng)時間1天左右,能比多管發(fā)酵法更快地獲得結(jié)果,還具有高度的再現(xiàn)性和精密性。此外由于采用單片無菌包裝,節(jié)省了滅菌時間,還避免操作過程中的二次污染,并且長有菌落的濾膜片可在紫外線滅菌、干燥后作為檢測記錄*保存,更符合計量認證規(guī)范。
3.檢測成本的考慮
⑴.多管發(fā)酵法所用的發(fā)酵管、小玻璃倒管和塑料蓋可在清洗、高壓滅菌和紫外線消毒后重復使用,液態(tài)培養(yǎng)基可自行配制或采用市售已配好的綜合培養(yǎng)基,檢測的成本不高。由于其方法較繁瑣,目前正有一種經(jīng)過US EPA認證的水和廢水中糞大腸菌群檢測的標準方法逐步取代它,這種在美國、日本和加拿大等廣泛使用的檢測技術(shù)在國內(nèi)也有一定使用(北京市環(huán)境檢測中心、北京市排水集團檢測中心等),這種方法就是使用IDEXX colilert試劑來檢測水中糞大腸菌,雖然它是基于多管發(fā)酵法原理,不過卻將其操作大大簡化了。當然,伴隨著操作的簡化,檢測成本也大幅提高,設備基本上全是進口的,前期投入大概在8萬元至10萬元人民幣之間,且由于采樣瓶、試劑和密封計數(shù)盤都是一次性使用,單個樣品的檢測成本也將達到200元人民幣左右。
⑵.濾膜法主要采用的抽濾裝置(拋光不銹鋼3歧管過濾器、500ml漏斗、無油隔膜真空正壓兩用泵和手動無菌水加液器)也基本上來自于進口,目前很多單位使用的都是德國賽多利斯公司生產(chǎn)的產(chǎn)品,其前期投入大概在2萬元至3萬元人民幣左右(包括100套無菌包裝的NPS,12元/每套)。由于每個樣品需采用3種不同的稀釋比進行過濾培養(yǎng),要使用3套NPS,所以單個樣品的檢測成本在50元人民幣左右。
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